Významný průlom ve strukturní biologii – mezinárodní tým pod vedením vědců z ELI Beamlines určil struktury proteinu s vysokým rozlišením z monokrystalu vypěstovaného uvnitř živé buňky. Podařilo se mu to díky nově vyvinuté metodě s názvem IncelluloED
Výzkumný tým vedli Vitalij Polovinkin z ELI Beamlines Facility v rámci Extreme Light Infrastructure ERIC v Praze a Lars Redecke z Ústavu biochemie Univerzity v Lübecku a německého elektronového synchrotronu (DESY) v Hamburku. Do spolupráce se zapojili také vědci z Ústavu molekulární genetiky AV ČR v Praze, Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích, Biologického centra AV ČR v Českých Budějovicích, evropského XFEL v německém Hamburku a Katedry buněčné a molekulární biologie Univerzity v Uppsale ve Švédsku.
Metoda s názvem IncelluloED kombinuje intracelulární krystalizaci proteinů s trojrozměrnou elektronovou difrakcí in situ. „S využitím široce dostupných nástrojů kryoelektronové mikroskopie umožňuje IncelluloED strukturní analýzu s vysokým rozlišením přímo uvnitř buněk, čímž eliminuje potřebu purifikace proteinů nebo růstu velkých krystalů mimo jejich přirozené prostředí,“ vysvětlil Vitalij Polovinkin.
Intracelulární krystalizace se ukázala jako slibná strategie ve strukturní biologii, ale stávající přístupy čelí značným omezením. V roce 2024 vědci z Univerzity v Lübecku představili projekt InCellCryst pro studium intracelulárních krystalů pomocí sériové rentgenové krystalografie. „Sériová krystalografie však vyžaduje expozici desítek tisíc buněk, což brání studiím s vysokým rozlišením na proteinech, které krystalizují pouze v několika buňkách,“ uvedl Lars Redecke. IncelluloED tuto bariéru překonává tím, že umožňuje stanovení struktury z jediného krystalu v rámci jediné buňky.
Výzkumníci demonstrovali sílu metody za použití mikrokrystalu proteinu HEX-1 z Magnaporthe grisea, pěstovaného v hmyzí buňce. „IncelluloED dosáhl struktury s rozlišením 1,9 Å z objemu krystalu přibližně 1,6 µm³, ve srovnání se strukturou 1,8 Å získanou sériovou rentgenovou krystalografií z kombinovaného objemu krystalu přesahujícího 11 milionů µm³. IncelluloED tak nabízí mnohamilionové snížení objemu vzorku potřebného pro stanovení struktury s vysokým rozlišením.“
Kromě okamžitého výkonu otevírá IncelluloED nové možnosti pro systematické studium intracelulární krystalizace, včetně určení, jak často proteiny krystalizují v buňkách, kolik intracelulárních krystalů difraktuje s vysokým rozlišením a jak dobře uspořádané oblasti lze identifikovat v krystalové lamele. Budoucí vývoj, jako je zavedení kofaktorů s malými molekulami do hostitelských buněk, by mohl dále rozšířit potenciál metody pro objevování léčiv založených na struktuře.
Navzdory zdánlivé složitosti pracovního postupu se ukázalo, že je tento postup robustní: během studie se žádné krystaly neztratily a všechny se během testů difrakovaly s vysokým rozlišením. Vyžadováním pouze jednoho krystalu uvnitř jedné buňky a použitím standardních kryo-EM platforem přináší IncelluloED strukturní biologii s vysokým rozlišením do konvenčních laboratorních prostředí. Tato metoda představuje významný krok k novému paradigmatu v oboru, k realizaci laboratoře strukturní biologie s jednou buňkou .
Nová metoda byla zveřejněna v časopise Nature Communications.
Ilustrace: Lucas J. Martin, Biofyzikální institut Maxe Plancka, Frankfurt nad Mohanem, Německo
Zdroj: ELI Beamlines
- Autor článku: ne
- Zdroj: ELI Beamlines
